磷脂微管材料在膜蛋白研究中的应用
东京农工大学大学院工学府的石坂龙（硕士毕业）、河北杏树（硕士毕业）、岩崎彩花（硕士在读）、吉泽宪（博士毕业），以及该...
东京农工大学大学院工学府的石坂龙（硕士毕业）、河北杏树（硕士毕业）、岩崎彩花（硕士在读）、吉泽宪（博士毕业），以及该大学院工学研究院应用化学部门的村西和佳特任助教、内田纪之特任讲师、村冈贵博教授，东京大学大学院工学系研究科应用化学专业的上野博史讲师、野地博行教授，国立癌症研究中心尖端生物成像研究领域的笠井伦志单元长，东京科学大学综合研究院脑功能整合研究中心的味冈逸树教授，北里大学大学院理学研究科生物科学专业的栗原三朗（硕士毕业），同大学未来工学研究科生命数据科学专业的野口智希（硕士课程），同大学未来工学部数据科学学科的渡边豪教授，东北大学大学院生命科学研究科的横山武司助教，同大学跨学科科学前沿研究所的金村进吾助教、奥村正树国际卓越副教授的研究团队，成功开发出一种在极端外部环境下仍能保持结构稳定的高稳健性磷脂微管——PMTPCaL。
PMTPCaL 是在发生膜相分离的磷脂膜上，通过PCaL的自组装构建而成。该材料在酸性/碱性条件、高温、高盐浓度、高渗透压、细胞内模拟的夹杂环境以及光镊物理拉伸等苛刻条件下，均表现出极高的结构稳定性。研究团队将PMTPCaL作为膜结合蛋白SNX1的支架材料，评估其吸附行为。结果显示，在模拟细胞内环境的夹杂条件下，SNX1与磷脂微管的结合显著增强，其解离常数 Kd 小于 2.2 μM。这一现象表明，细胞内复杂的生物物理环境可能通过排除体积效应（注14）增强蛋白与膜之间的相互作用。
在细胞内，SNX1参与调控由内体转化为脂质微管的路径。在夹杂环境中增强的膜结合能力，可能反映了其进化过程中形成的功能优化机制，以确保在细胞环境中高效执行功能。这一在以往研究中未被揭示的现象，得益于PMTPCaL的高稳健性才得以发现。
背景
在内质网（注6）和神经突起（注7）等结构中观察到的脂质微管，是作为膜结合蛋白支架的重要结构基础。过去，研究人员曾利用生物分子马达（注8）或外加电场等方式构建人工脂质微管，然而这些方法所获得的微管在热力学上均不稳定，限制了其在生物学研究中的广泛应用。
研究内容与成果
由不饱和脂质1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC，注9）、饱和脂质1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC，注10）以及胆固醇（Chol）组成的三元脂质体系可形成脂质双分子膜。该膜会发生相分离，形成富含DOPC的低有序相（Ld）区域和富含DPPC的高有序相（Lo）区域。通常，膜相分离的形成会驱动膜结构发生形变。本研究基于DOPC/DPPC/Chol三元体系，旨在通过调控膜相分离诱导膜形变，设计了一种结合四赖氨酸的阳离子脂质PCaL，以及由四个天冬氨酸组成的阴离子配体Asp4（图1a）。
通过相差显微镜观察发现，在DOPC/DPPC/Chol三元脂质体系中加入PCaL后，可形成球状脂质聚集体（图1b，图2a）。进一步加入Asp4后，脂质聚集体发生显著形变，自发组装形成磷脂微管PMTPCaL（图1b，图2b–f）。共聚焦显微镜（图2g）和冷冻透射电子显微镜（注11，图2h）观察结果证实，所形成的结构具有中空管状特征。通过原子力显微镜（注12）和分子动力学模拟（注13），研究团队评估了在DPPC/DOPC/Chol/PCaL四组分脂质膜中加入Asp4后PCaL的分布及膜相分离的形成情况。结果显示，在加入Asp4前，PCaL在膜中呈分散状态，整体膜未发生相分离；而加入Asp4后，PCaL在膜中发生自聚集，并诱导形成膜相分离，从而驱动PMTPCaL的自发形成。
为探索PMTPCaL在生物学研究中作为膜结合蛋白支架材料的潜力，研究团队系统评估了其对外部环境的耐受性。传统的磷脂微管通常依赖生物分子马达或光镊构建，需持续施加化学或物理能量以维持管状结构，一旦能量撤除，结构即发生崩塌。此外，这些微管在高温、高渗透压或夹杂环境中也难以保持结构稳定，严重限制了其实际应用。令人惊讶的是，PMTPCaL在酸性/碱性条件、高温、高盐浓度、高渗透压、夹杂环境等多种极端条件下，均能长时间维持结构完整，展现出卓越的稳健性（图2i–q）。
为进一步评估PMTPCaL的物理性质，研究团队使用表面修饰有膜结合蛋白SNX1的聚苯乙烯微珠，在PMTPCaL表面进行吸附，并利用光镊分别沿微管长轴方向和垂直方向进行拉伸实验（图3a–c）。结果显示，在沿长轴方向拉伸时，微珠可平滑移动（图3d–f）；而在垂直方向拉伸时，微管发生弯曲，并在微珠脱离后迅速恢复直线形态（图3g–i），表现出明显的弹性行为。物理分析表明，该微管具有超过0.92 pN的回复力。传统磷脂微管通常不具备弹性恢复能力，因此这一特性成为PMTPCaL的独特优势。
研究团队进一步利用PMTPCaL作为SNX1的支架，评估其在夹杂环境中的功能表现。通过使用荧光标记的SNX1，比较了其在无夹杂物的缓冲液条件与模拟细胞内环境的高浓度聚乙二醇（PEG）条件下的结合行为（图4a）。共聚焦显微镜观察显示，在含有长链PEG的夹杂环境中，PMTPCaL表面结合的SNX1荧光信号显著强于非夹杂条件（图4b–h）。该结果表明，SNX1与磷脂微管的结合在排除体积效应的影响下得到增强，进一步支持了PMTPCaL在模拟真实细胞环境研究中的实用价值。
未来展望
本研究构建的高稳健性磷脂微管PMTPCaL，可被视为继脂质体（球形）和双胞体（盘形）之后的第三类磷脂自组装材料。由于其具有高曲率和延伸的管状结构，PMTPCaL相较于悬浮性脂质体或双胞体，更易于实现位置固定与长时间观测，适用于多种环境条件下对膜结合蛋白等生物分子的动态行为研究。
PMTPCaL主要由天然脂质（>99 mol%）构成，无需复杂设备，仅通过添加Asp4即可简便构建。其优异的稳健性使其成为理想的膜结合蛋白支架材料，适用于定量功能评估。本研究为分子生物学研究提供了新型材料基础，未来有望推动针对动力蛋白（注15）、肌动蛋白（注16）等重要膜结合蛋白的功能解析，进一步拓展其在生命科学前沿研究中的应用前景。
研究团队与资助
本研究由东京农工大学大学院工学研究院应用化学部门的村冈贵博教授、东京大学大学院工学系研究科应用化学专业的野地博行教授、国立癌症研究中心尖端生物成像研究领域的笠井伦志单元长、东京科学大学综合研究院脑功能整合研究中心的味冈逸树教授、北里大学大学院未来工学研究科生命数据科学专业的渡边豪教授、东北大学大学院生命科学研究科的横山武司助教、同大学跨学科科学前沿研究所的奥村正树国际卓越副教授为核心的研究团队共同完成。
本研究获得了以下机构与项目的资助：
科学技术振兴机构（JST）创发研究支援事业（项目编号：JPMJFR2122，研究代表：村冈贵博）、JST战略性创造研究推进事业CREST（项目编号：JPMJCR19S4，研究代表：村冈贵博）、日本学术振兴会科学研究费助成事业学术变革领域研究B（项目编号：JP21H05096，研究代表：村冈贵博）、基盘研究B（项目编号：JP25K01891，研究代表：村冈贵博）、基盘研究C（项目编号：JP23K04927，研究代表：内田纪之）、国立研究开发法人新能源产业技术综合开发机构（NEDO）、官民联合青年研究者发掘支援事业（项目编号：23W1M041，研究代表：内田纪之），以及以下基金会：Canon基金会（村冈贵博）、旭硝子基金会（村冈贵博、内田纪之）、新化学技术推进协会（内田纪之）、守谷育英会（内田纪之）、田中贵金属纪念财团（内田纪之）、KOSE Cosmetology Research Foundation（内田纪之）、Lotte基金会（内田纪之）。
PMTPCaL 是在发生膜相分离的磷脂膜上，通过PCaL的自组装构建而成。该材料在酸性/碱性条件、高温、高盐浓度、高渗透压、细胞内模拟的夹杂环境以及光镊物理拉伸等苛刻条件下，均表现出极高的结构稳定性。研究团队将PMTPCaL作为膜结合蛋白SNX1的支架材料，评估其吸附行为。结果显示，在模拟细胞内环境的夹杂条件下，SNX1与磷脂微管的结合显著增强，其解离常数 Kd 小于 2.2 μM。这一现象表明，细胞内复杂的生物物理环境可能通过排除体积效应（注14）增强蛋白与膜之间的相互作用。
在细胞内，SNX1参与调控由内体转化为脂质微管的路径。在夹杂环境中增强的膜结合能力，可能反映了其进化过程中形成的功能优化机制，以确保在细胞环境中高效执行功能。这一在以往研究中未被揭示的现象，得益于PMTPCaL的高稳健性才得以发现。
背景
在内质网（注6）和神经突起（注7）等结构中观察到的脂质微管，是作为膜结合蛋白支架的重要结构基础。过去，研究人员曾利用生物分子马达（注8）或外加电场等方式构建人工脂质微管，然而这些方法所获得的微管在热力学上均不稳定，限制了其在生物学研究中的广泛应用。
研究内容与成果
由不饱和脂质1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC，注9）、饱和脂质1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC，注10）以及胆固醇（Chol）组成的三元脂质体系可形成脂质双分子膜。该膜会发生相分离，形成富含DOPC的低有序相（Ld）区域和富含DPPC的高有序相（Lo）区域。通常，膜相分离的形成会驱动膜结构发生形变。本研究基于DOPC/DPPC/Chol三元体系，旨在通过调控膜相分离诱导膜形变，设计了一种结合四赖氨酸的阳离子脂质PCaL，以及由四个天冬氨酸组成的阴离子配体Asp4（图1a）。
通过相差显微镜观察发现，在DOPC/DPPC/Chol三元脂质体系中加入PCaL后，可形成球状脂质聚集体（图1b，图2a）。进一步加入Asp4后，脂质聚集体发生显著形变，自发组装形成磷脂微管PMTPCaL（图1b，图2b–f）。共聚焦显微镜（图2g）和冷冻透射电子显微镜（注11，图2h）观察结果证实，所形成的结构具有中空管状特征。通过原子力显微镜（注12）和分子动力学模拟（注13），研究团队评估了在DPPC/DOPC/Chol/PCaL四组分脂质膜中加入Asp4后PCaL的分布及膜相分离的形成情况。结果显示，在加入Asp4前，PCaL在膜中呈分散状态，整体膜未发生相分离；而加入Asp4后，PCaL在膜中发生自聚集，并诱导形成膜相分离，从而驱动PMTPCaL的自发形成。
为探索PMTPCaL在生物学研究中作为膜结合蛋白支架材料的潜力，研究团队系统评估了其对外部环境的耐受性。传统的磷脂微管通常依赖生物分子马达或光镊构建，需持续施加化学或物理能量以维持管状结构，一旦能量撤除，结构即发生崩塌。此外，这些微管在高温、高渗透压或夹杂环境中也难以保持结构稳定，严重限制了其实际应用。令人惊讶的是，PMTPCaL在酸性/碱性条件、高温、高盐浓度、高渗透压、夹杂环境等多种极端条件下，均能长时间维持结构完整，展现出卓越的稳健性（图2i–q）。
为进一步评估PMTPCaL的物理性质，研究团队使用表面修饰有膜结合蛋白SNX1的聚苯乙烯微珠，在PMTPCaL表面进行吸附，并利用光镊分别沿微管长轴方向和垂直方向进行拉伸实验（图3a–c）。结果显示，在沿长轴方向拉伸时，微珠可平滑移动（图3d–f）；而在垂直方向拉伸时，微管发生弯曲，并在微珠脱离后迅速恢复直线形态（图3g–i），表现出明显的弹性行为。物理分析表明，该微管具有超过0.92 pN的回复力。传统磷脂微管通常不具备弹性恢复能力，因此这一特性成为PMTPCaL的独特优势。
研究团队进一步利用PMTPCaL作为SNX1的支架，评估其在夹杂环境中的功能表现。通过使用荧光标记的SNX1，比较了其在无夹杂物的缓冲液条件与模拟细胞内环境的高浓度聚乙二醇（PEG）条件下的结合行为（图4a）。共聚焦显微镜观察显示，在含有长链PEG的夹杂环境中，PMTPCaL表面结合的SNX1荧光信号显著强于非夹杂条件（图4b–h）。该结果表明，SNX1与磷脂微管的结合在排除体积效应的影响下得到增强，进一步支持了PMTPCaL在模拟真实细胞环境研究中的实用价值。
未来展望
本研究构建的高稳健性磷脂微管PMTPCaL，可被视为继脂质体（球形）和双胞体（盘形）之后的第三类磷脂自组装材料。由于其具有高曲率和延伸的管状结构，PMTPCaL相较于悬浮性脂质体或双胞体，更易于实现位置固定与长时间观测，适用于多种环境条件下对膜结合蛋白等生物分子的动态行为研究。
PMTPCaL主要由天然脂质（>99 mol%）构成，无需复杂设备，仅通过添加Asp4即可简便构建。其优异的稳健性使其成为理想的膜结合蛋白支架材料，适用于定量功能评估。本研究为分子生物学研究提供了新型材料基础，未来有望推动针对动力蛋白（注15）、肌动蛋白（注16）等重要膜结合蛋白的功能解析，进一步拓展其在生命科学前沿研究中的应用前景。
研究团队与资助
本研究由东京农工大学大学院工学研究院应用化学部门的村冈贵博教授、东京大学大学院工学系研究科应用化学专业的野地博行教授、国立癌症研究中心尖端生物成像研究领域的笠井伦志单元长、东京科学大学综合研究院脑功能整合研究中心的味冈逸树教授、北里大学大学院未来工学研究科生命数据科学专业的渡边豪教授、东北大学大学院生命科学研究科的横山武司助教、同大学跨学科科学前沿研究所的奥村正树国际卓越副教授为核心的研究团队共同完成。
本研究获得了以下机构与项目的资助：
科学技术振兴机构（JST）创发研究支援事业（项目编号：JPMJFR2122，研究代表：村冈贵博）、JST战略性创造研究推进事业CREST（项目编号：JPMJCR19S4，研究代表：村冈贵博）、日本学术振兴会科学研究费助成事业学术变革领域研究B（项目编号：JP21H05096，研究代表：村冈贵博）、基盘研究B（项目编号：JP25K01891，研究代表：村冈贵博）、基盘研究C（项目编号：JP23K04927，研究代表：内田纪之）、国立研究开发法人新能源产业技术综合开发机构（NEDO）、官民联合青年研究者发掘支援事业（项目编号：23W1M041，研究代表：内田纪之），以及以下基金会：Canon基金会（村冈贵博）、旭硝子基金会（村冈贵博、内田纪之）、新化学技术推进协会（内田纪之）、守谷育英会（内田纪之）、田中贵金属纪念财团（内田纪之）、KOSE Cosmetology Research Foundation（内田纪之）、Lotte基金会（内田纪之）。
